A Raman-mikroszkópia (µ-Raman) a kémiai elemzési technikát, a Raman-spektroszkópiát ötvözi a hagyományos fénymikroszkóppal. Ez a kombináció egy nagyon leegyszerűsített, „célozz és lőjj” megközelítést biztosít a nagyon apró objektumok Raman-spektroszkópiájához. A felhasználók közvetlenül kiválaszthatják a mintán a kémiai elemzéshez szükséges területeket a mikroszkóp segítségével történő vizualizáció révén.
A Raman-mikroszkópia ugyanarra az elvre épül, mint a Raman-spektroszkópia, amikor egy minta kémiai összetételét azonosítja. Először egy lézer (leggyakrabban egy 532 nm-es vagy 785 nm-es hullámhosszú lézer) megvilágítja a mintát, kölcsönhatásba lép vele, majd a lézerfény szóródik a minta felületéről. A szóródás kétféle módon történhet: Rayleigh-szórással vagy Raman-szórással.
A kémiai analízis szempontjából a Raman-szórt fény a hasznos. Ez a szórás rugalmatlan (inelastic), ami azt jelenti, hogy a Raman-szórt fény frekvenciája, hullámhossza és színe eltér az eredeti beeső fényétől.
A Raman-mérés során a Raman-szórt fényt detektálják, hogy létrehozzák a Raman-spektrumot. Ez a spektrum egyedi az adott mintában jelen lévő kémiai vegyületekre, ezért „kémiai ujjlenyomatként” szolgál, amely felhasználható a mintában jelenlévő összes különböző kémiai vegyület azonosítására, mennyiségi meghatározására és jellemzésére.
A Raman-spektroszkópia segítségével gyakorlatilag bármit elemezhetünk, amennyiben a lézerfény eléri a mintát. Ez azt jelenti, hogy a Raman-mikroszkópia bármilyen, a mintatartóra helyezhető mintát képes vizsgálni, mindenféle mintaelőkészítés nélkül. Alkalmazható akár üveg mögött lévő minták, átlátszó csomagolásban lévő anyagok vagy vízben található minták elemzésére is.
A Raman-spektroszkópiának azonban vannak korlátai, amelyek a Raman-mikroszkópiára is érvényesek. Bár elvileg bármilyen minta vizsgálható, egyes kémiai vegyületek Raman-jele túl gyenge ahhoz, hogy jó minőségű spektrumot adjon, ezért ezek nehezen elemezhetők ezzel a módszerrel.
A fluoreszcencia szintén komoly problémát jelent a Raman-spektroszkópiában. Ha a minta fluoreszcenciát mutat, a kibocsátott fény sokkal erősebb lehet, mint maga a Raman-effektus, ami megnehezíti a Raman-csúcsok elkülönítését a zajtól.
Mivel a legtöbb Raman-mérés a látható tartományba eső lézert használ, viszonylag egyszerű egy Raman-spektrométert mikroszkóppal kombinálni. Végül is a mikroszkópokat már eleve úgy tervezték, hogy látható fénnyel működjenek. Az egyetlen lényeges szempont a megfelelő mikroszkóptípus kiválasztása, mivel számos különböző kialakítás létezik. A legtöbb Raman-mikroszkóp konfokális elrendezést alkalmaz a felbontás és a spektrális minőség maximalizálása érdekében.
Ennek megfelelően a konfokális kialakítást fogjuk részletesen tárgyaljuk.
A mikroszkóp első része a mintatartó. Miután a mintát elhelyezzük ezen, a mikroszkóppal megfigyelhetjük, majd kiválaszthatjuk az elemzés szempontjából érdekes területet.
Ezután a lézer fénye a mintára irányul, és az objektívlencse fókuszálja. A lézerfény kölcsönhatásba lép a mintával, majd szóródik róla, és az összes szórt fény visszahalad az objektívlencsén keresztül.
Ez a szórt fény tartalmazza mind a Raman-, mind a Rayleigh-szórt komponenseket, de a kémiai analízishez csak a Raman-fény hasznos. Ezért a Rayleigh-komponenst egy szűrővel eltávolítják. A megmaradó Raman-szórt fényt egy konfokális pinhole fókuszálja, majd a spektrométerbe irányítják, amely hullámhossz szerint szétválasztja és detektálja azt.
Miután a Raman-szórt fényt detektálják, létrejön a Raman-spektrum. A vizsgált területhez tartozó spektrum rendkívül gazdag kémiai információt tartalmaz, amely felhasználható az ott jelen lévő kémiai vegyületek azonosítására és jellemzésére. Számítógépes szoftverek segítségével ezek a kémiai vegyületek az adott területen automatikusan is azonosíthatók.
Lézerek
Bár a Raman-spektroszkópiában és -mikroszkópiában leggyakrabban egy zöld, 532 nm-es lézert alkalmaznak, ez nem az egyetlen lehetőség. Más, Raman-kísérletekhez gyakran használt lézerek közé tartozik a 488 nm-es kék lézer, a 633 nm-es vörös lézer, valamint a 785 nm-es infravörös lézer.
A különböző minták eltérő lézereket igényelhetnek az érzékenység és a felbontás maximalizálása, illetve a fluoreszcencia elkerülése érdekében. Éppen ezért sok Raman-mikroszkóp többféle lézerrel van felszerelve, és alapvető követelmény, hogy ezek között gyorsan és egyszerűen lehessen váltani.
Objektívek
Mivel a Raman-mikroszkópban a fény általában az objektívlencsén keresztül jut vissza a detektor felé, az objektív jelentős hatással van a térbeli felbontásra. Az objektív numerikus apertúrája [ÉF1.1][IF1.2]határozza meg különösen azt, hogy mennyi fény tud áthaladni rajta, valamint a fókusztávolságot is. Minél nagyobb az objektívlencse numerikus apertúrája, annál nagyobb a Raman-mikroszkóp térbeli felbontása.
Rácsok
A rács (diffrakciós rács) a spektrométer azon eleme, amely a fényt hullámhossz szerint szétválasztja a detektálás előtt. Egy Raman-műszer általában többféle rácsot tartalmaz, amelyek különböző vonalsűrűséggel rendelkeznek.
A rács vonalsűrűsége meghatározza, hogy a fény mennyire terül szét a detektoron. A szétterülés mértéke befolyásolja a spektrális felbontást, vagyis azt, hogy mennyire tudjuk elkülöníteni a Raman-spektrumban az egyes csúcsokat.
A spektrális felbontás változtatása lehetővé teszi, hogy a Raman-spektrum bizonyos részeit részletesebben vizsgáljuk, illetve hogy a mérést különböző lézerekhez optimalizáljuk.
Korábban említettük, hogy a legtöbb Raman-mikroszkóp konfokális kialakítású, de mit is jelent pontosan a konfokális mikroszkóp, és miért előnyös a Raman-mikroszkópiában?
Amikor a lézerrel megvilágítunk egy pontot a mintán, a fény nemcsak a felszínnel lép kölcsönhatásba, hanem – az anyag tulajdonságaitól függően – viszonylag mélyen be is hatolhat a mintába. Ugyanakkor, amikor egy adott területet választunk ki elemzésre, csak az adott fókuszsíkhoz tartozó fényt szeretnénk detektálni.
Ez a konfokális mikroszkóp előnye. Ez a kialakítás egy tűlyukat (pinhole) használ arra, hogy megakadályozza a fókuszon kívüli fény detektorba jutását. A fókuszálatlan fény eltávolításával javíthatjuk a térbeli felbontást, vagyis azt, hogy mennyire „éles” a mikroszkóp által létrehozott kép. Ez különösen hasznos a Raman-képalkotásban, ahol nagy térbeli felbontásra van szükség a részletes kémiai térképek elkészítéséhez.
A konfokális pinhole a Raman-spektrum minőségét is javíthatja azáltal, hogy eltávolítja a fluoreszcenciából származó fény hatását. Bár a fluoreszcencia gyakran mérsékelhető eltérő hullámhosszú lézer használatával, ez nem mindig megoldható. Ilyenkor a fluoreszcenciából származó fény eltávolításával könnyebben nyerhetünk tiszta Raman-spektrumot.
A konfokális elrendezés további előnye, hogy lehetővé teszi a fókuszsík változtatását. Ez azt jelenti, hogy a minta különböző mélységeiből származó fényt szelektíven vizsgálhatjuk, így a minta háromdimenziós elemzése is megvalósítható.
A konfokális mikroszkópia esetében vannak bizonyos kompromisszumok, ezért a Raman-mikroszkópokban többféle megvalósítás is létezik:
A valódi konfokális elrendezés pontosan a korábban leírt elv szerint működik: egy konfokális tűlyuk (pinhole) eltávolítja a fókuszon kívüli fényt, mielőtt az a spektrométerbe jutna, ezáltal javítva a térbeli felbontást. Ahogy azonban a fény belép a spektrométerbe, egy bemeneti résen (entrance slit) is áthalad, amely tovább szűri a fényt. Ez a rés határozza meg a spektrális felbontást is, vagyis azt, hogy mennyire különíthetők el a Raman-spektrumban az egyes csúcsok. A konfokális tűlyuk és a bemeneti rés pontos illesztése szükséges a jó teljesítményhez, azonban ez nehezen fenntartható, és csökkentheti a rendszer fényáteresztő képességét (throughput).
A pszeudo-konfokális kialakítás ezt a problémát úgy kerüli meg, hogy elhagyja a konfokális tűlyukat. Ehelyett a bemeneti rést és a detektort egymásra merőlegesen (ortogonálisan) helyezi el, ami részben kiváltja a fókuszon kívüli fény kiszűrését. A rendszer egyszerűsítése növeli a fényáteresztést, viszont a térbeli felbontás rovására.
Mindkét megközelítésnek vannak előnyei, ezért a hibrid-konfokális kialakítás ezek kombinációját alkalmazza. Ez lehetővé teszi a valódi konfokális működés és a nagyobb átviteli hatásfok közötti választást. Ezt egy olyan hibrid tűlyuk–rés (pinhole–slit) mátrix segítségével valósítja meg, amely szükség szerint a bemeneti rés vagy a konfokális tűlyuk szerepét töltheti be.
